miRNA的功能剖析策略

 
lin-4，第1个已知的miRNA，在1993年被发觉。自此，miRNA的研讨就一发无法收拾。线虫、蜾蠅等标准样式有生命的物质的研讨鉴定出miRNA的很多重邀功能，涵盖发育时期细胞增生和失去生命的协调，抗逆性，脂肪代谢等等。相对于这些个劣等的标准样式有生命的物质，哺乳动物的miRNA功能研讨可就复杂得多。

在着手的几年，科学家们的首重要的条目标是利用克隆、有生命的物质信息学和基因表现等办法编缀出完整的miRNA目次和它的表现形式。随着这个目的一天比一天靠近，研讨重心又转移至miRNA功能的解释。针对这一目的，涌现出多种技术，有报告陈述基因剖析、原位杂交、过表现和沉默、有生命的物质信息学预先推测算法等，他们都有助于miRNA功能的推断。

剖析miRNA的表现

在鉴定新的miRNA时，一般认为合适而使用三种办法：正向遗传基因学、定向克隆和有生命的物质信息学剖析。正向遗传基因学主要使用于蜾蠅和线虫中，它经过一个突变表型来理解miRNA的功能。第1个miRNA基因lin-4就是这样鉴定出的。不过，正向遗传基因学这样积年来也就鉴定出非常少几个miRNA。这是由于miRNA细小，只要突变不影响胚珠序列，他们就有潜在力量耐受，因为这个很难击中。额外，因为冗余，表型用筛子选不可以辨别众多miRNA突变体。因为这个正向遗传基因学没可能变成鉴定miRNA的主力军。

在这以后，定向克隆技术的显露出来，让多种细胞系和团体中的miRNA大规模鉴定得以成功实现，涵盖人、小鼠和斑马鱼等。miRNA的克隆流程大概如下所述：在改变性别的聚丙烯酰胺凝胶上离合RNA样品，并回收体积在18-25 nt的断片。继续，给RNA加上5’和3’接头，并施行RT-PCR，而后将断片克隆到载体上，构建出cDNA文库。对单个克隆施行测序和剖析，以确认小RNA。到现在为止测序技术的兴盛也大大增进了这种办法。不过对于某些只在特别细胞类型中表现，或以低水准表现的miRNA来说，鉴定起来仍然有困难程度的。额外，介于物理性质或转录后修饰，某些miRNA有可能难于克隆，这也是一个棘手的问题。

同时，科学家们也研发出多种算法，来预先推测miRNA。所得法法都利用了二级结构信息，由于发夹结构的存在是miRNA的主要特点标志。那里面很多办法还有赖序列的守旧性来区别miRNA候选物和无关的基因组发夹。另一点办法则评估发夹结构的热力科学牢稳性，与已知miRNA的序列和结构相仿度。另一种的办法是考求已知miRNA四周围的基因组序列，由于很多miRNA都是成簇排布。上下团结小鼠的很多miRNA就是经过这种形式鉴定出的。当然，计算机预先推测出来的候选miRNA还需求实验的证验。